Western Blot实验过程

操作规程：

1.制胶和制样

  (1)制备相应浓度的PAGE胶;

  (2)根据实验需求取适量抗原样品，加入2*或5*上样缓冲液，充分混匀后100度水浴10min，然后10000rpm 离心5min.

2.电泳

  (1)按SDS-PAGE操作规程装好电泳装置，按实验设计上样，每个泳道**上样量30ul，预染Marker上样3ul，需要根据蛋白大小确定使用哪种Marker.

  (2)上样完毕后，接通电源，按胶的不同选取不同的起始电压。自制聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至120V直到电泳结束。

3.转膜

  (1)电泳结束后，将凝胶放置转膜液里浸泡5-10min，PVDF膜在甲醇中浸泡15s,膜成半透明状，在超纯水中冲洗一下，放入转膜液中转膜浸泡后转膜。转膜顺序为：负极-海绵垫-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵垫-正极。如同时操作多张膜需在膜上编号以便区分。

  (2)恒流280mA，根据分子量大小确定转膜时间。分子量>80KD转膜时间1.5-2小时，分子量＜80KD转膜时间1小时，分子量＜20KD转膜时间45min，恒流200mA.

4.封闭

  电转结束后，取出膜用PBST洗涤4次，每次5min。然后置于37度摇床封闭1小时。视情况而定采用封闭液。

5.一抗孵育

  PBST稀释一抗（稀释倍数视情况而定），稀释体积一般3-4ml放于抗体孵育盒中4度过夜，内参可以37度1小时。

6.洗膜

  一抗结束后，用PBST洗涤4次，可以37度也可以25度，每次5min（磷酸化抗体可以洗三次，每次5min）。

7.二抗孵育

   用5%的牛奶封闭的稀释二抗（1:10000）.膜在二抗中37度1小时。3.8洗膜4次同上。

8.洗膜4次同上

9.显影

  ECL法：

  (1)用平板纸吸去膜上的水分，将膜放置于平面上，取等体积的ECL液A和B液混匀后加入膜上反应1min

  (2)然后取膜弃去ECL发光液于暗盒中显影，可根据背景及条带的强弱选择不同的曝光时间。

  (3)记录好显影时间及配置时间，一般显影液可使用1-2周，定影液2-3周，像信号较弱的，可通过更换显影液加强显影的强度。