SDS-PAGE 实验过程

试剂配制

  30%丙烯酰胺(29:1)： 称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至100 mL，用0.45um滤膜滤杂质，于中4℃避光保存。

  1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) ： 称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至8.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。

  0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8) ：称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至6.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。

  10 %过硫酸胺(AP) ：称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 ℃避光保存，保存时间不能超过1周

  5×Tris-Glycine电泳缓冲液：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。

  考马斯亮蓝染色液：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。

  脱色液：取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶至1L，搅拌均匀，室温保存备用。

实验过程

1.根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶

2.凝胶配制

  (1)组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

  2.分离胶的配置

  12%分离胶配方如下表：

  3.灌胶

  混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。

  4.液封

  在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层无水乙醇以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

关键点：无水乙醇封胶之后，将无水乙醇掉到后液面必须水平平整。

  5.浓缩胶的配制

  浓缩胶的配方如:

关键点：浓缩胶在配置过程中夏天温度较高，TEMED的要减少三分之一的量。

  6.插入制胶梳

  混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

电泳

  1.安装电泳槽

  将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块12%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X Tris-Gly电泳缓冲液。

关键点：短玻璃板放置内侧。

  2.样品处理

  样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。煮沸10分钟。12000rpm离心10min，备用。

  3.加样

  用移液枪取处理过的样品溶液5μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

关键点：鉴定图片样品点样时一定要去上清，样品粘稠不能进行上样，否则图片会模糊条带不清晰。

  4.电泳

  将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好（以盖子盖严为准，盖子有两个小洞，这与电泳槽是对应的）。电压调至约80v保持恒压。待溴酚蓝在浓缩胶和分离胶界面压成一条直线后，调整电压至120v，溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

  5.剥离胶

  把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，轻轻取下凝胶，放置于含有20ml染色液的器皿中。

  6.染色

  将器皿至于微波炉中，中火加热10min，取出置于摇床上，轻摇约0.5小时，完成后染液回收并用水洗掉染液。

  7.脱色

  取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可将器皿至于微波炉中，中火加热10min，置于摇床上，轻摇过夜，次日将胶放置于清水中，直至背景清楚为止。

关键点：脱色过程中不能将蛋白条带脱太淡。

  (8.拍照

  将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。