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SDS-PAGE 实验过程

发表时间:2021-09-27 08:12
试剂和耗材
Protein Marker(购自Thermo公司)IPTG、Acr、Bis、Tris(购自Sigma公司)
SDS(购自Amresco公司)TEMED(购自BIO-RAD公司)
0.22 μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司)其它试剂均为国产分析纯
主要实验仪器
Allegra 21R台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)台式高速离心机(德国SORVAL公司)
Mini Protean II垂直平板电泳系统、GeL Doc2000成像系统(美国BIO-RAD公司)320-S pH计(美国MettLer ToLedo公司)
雪花状制冰机(日本SANYO公司)

试剂配制

  30%丙烯酰胺(29:1): 称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g,加入约60 ml的去离子水,充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至100 mL,用0.45um滤膜滤杂质,于中4℃避光保存。

  1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) : 称取Tris-base 45.43 g,加入约200 mL去离子水,搅拌溶解;用浓盐酸调pH至8.8,最后用去离子水定容至250 mL,室温下保存。

  0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8) :称取Tris-base 15.14 g,加入约200 mL去离子水,搅拌溶解;用浓盐酸调pH至6.8,最后用去离子水定容至250 mL,室温下保存。

  10 %过硫酸胺(AP) :称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中,充分混匀后于4 ℃避光保存,保存时间不能超过1周

  5×Tris-Glycine电泳缓冲液:称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中,加入约800 mL的去离子水,搅拌溶解;加去离子水将溶液定容至1 L后,室温保存。

  考马斯亮蓝染色液:称取1 g考马斯亮蓝R-250,置于1 L烧杯中;量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解;加入100 mL的冰醋酸,搅拌均匀;加入650 mL去离子水,搅拌均匀;用滤纸除去颗粒物质后,室温保存备用。

  脱色液:取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL,加去离子水定溶至1L,搅拌均匀,室温保存备用。

实验过程

1.根据目的蛋白的大小,选择合适的分离胶

SDS-PAGE分离胶浓度**分离范围
6%胶50-150kD
8%胶30-90kD
10%胶20-80kD
12%胶12-60kD
15%胶10-40kD

2.凝胶配制

  (1)组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐,形成空腔,插入塑料框的凹槽中,注意箭头向上,并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧,下端紧贴密封条。

  2.分离胶的配置

  12%分离胶配方如下表:

成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
12%胶体积510152030
蒸馏水1.02.03.04.06.0
30%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.0
1.5M Tris,pH8.81.93.85.77.611.4
10%SDS0.050.10.150.20.3
10%过硫酸铵0.050.10.150.20.3
TEMED0.0020.0040.0060.0080.012

  3.灌胶

  混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。

  4.液封

  在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层无水乙醇以隔绝空气,使胶面平整。静置约30min观察胶面变化,当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时,表明胶已完全凝固,倒掉上层水,并用滤纸吸干残留的水液。

关键点:无水乙醇封胶之后,将无水乙醇掉到后液面必须水平平整。

  5.浓缩胶的配制

  浓缩胶的配方如:

成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)
5%胶体积2346810
蒸馏水1.42.12.74.15.56.8
30%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.7
1M Tris,pH6.80.250.380.50.761.01.25
10%SDS0.020.030.040.060.080.1
10%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1
TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01

关键点:浓缩胶在配置过程中夏天温度较高,TEMED的要减少三分之一的量。

  6.插入制胶梳

  混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方),轻轻加入样品模板梳,小心避免气泡的出现。约30分钟,聚合完全。

电泳

  1.安装电泳槽

  将制备好的凝胶板取下,小心拔下梳子。两块12%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中,可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上,其下缘与贮槽框下缘对齐,放入电泳槽内。倒入1X Tris-Gly电泳缓冲液。

关键点:短玻璃板放置内侧。

  2.样品处理

  样品直接取80µl的样品,依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇),混匀。煮沸10分钟。12000rpm离心10min,备用。

  3.加样

  用移液枪取处理过的样品溶液5μl,小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内,marker 加入到其中一个槽内,为区别两块板,marker可加在不同的孔槽中。

关键点:鉴定图片样品点样时一定要去上清,样品粘稠不能进行上样,否则图片会模糊条带不清晰。

  4.电泳

  将电泳槽放置电泳仪上,接通电源,正负极对好(以盖子盖严为准,盖子有两个小洞,这与电泳槽是对应的)。电压调至约80v保持恒压。待溴酚蓝在浓缩胶和分离胶界面压成一条直线后,调整电压至120v,溴酚蓝标记移动到凝胶底部时,关电源,把电泳缓冲液倒回瓶中。

  5.剥离胶

  把电泳槽取出,两块板拿下来,用刮片从长短玻片中间翘起,轻轻取下凝胶,放置于含有20ml染色液的器皿中。

  6.染色

  将器皿至于微波炉中,中火加热10min,取出置于摇床上,轻摇约0.5小时,完成后染液回收并用水洗掉染液。

  7.脱色

  取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里,脱色液漫过胶即可将器皿至于微波炉中,中火加热10min,置于摇床上,轻摇过夜,次日将胶放置于清水中,直至背景清楚为止。

关键点:脱色过程中不能将蛋白条带脱太淡。

  (8.拍照

  将脱色后的胶置于透明文件夹中,把胶上面的气泡赶出(用前也可用酒精棉球擦干净文件夹),放到扫描仪上,拍照。


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