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His包涵体纯化过程

发表时间:2021-09-27 08:09
试剂和耗材
TOP10 菌株(Apeptide保种)BL21(DE)3PlyssTM表达菌(Apeptide保种)
Protein Marker(购自Thermo公司)IPTG、Acr、Bis、Tris(购自Sigma公司)
SDS(购自Amresco公司)TEMED(购自BIO-RAD公司)
Tryptone、Yeast Extract(购自 OXOID公司)0.22 μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司)
Ni-IDA亲和层析胶(购自Novagen公司)其它试剂均为国产分析纯
主要实验仪器
Allegra 21R台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)台式高速离心机(德国SORVAL公司)
Mini Protean II垂直平板电泳系统、GeL Doc2000成像系统(美国BIO-RAD公司)320-S pH计(美国MettLer ToLedo公司)
JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所)雪花状制冰机(日本SANYO公司)
超净工作台(中国苏净集团)

实验方法及结果

1.重组质粒载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中,置冰上30 min。

  (2)42℃热激90 sec,迅速置冰中5 min,加入600 μL LB培养液。

  (3)37℃,200 r/min振摇40 min,离心后全部涂布于含50 μg/mLAmp或Kan的LB平板,,37℃倒置培养过夜。

2.IPTG诱导重组菌融合蛋白的表达

  (1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中,37℃ 200 r/min振摇过夜。

  (2)次日按1:100接种于50 μg/mL Amp或Kan的30 mL LB培养液中,37℃ 200 r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。

  (3)取出1 mL培养物,10000 r/min室温离心2 min,弃上清,用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。

  (4)a.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM, 37℃ 200 r/min振摇4 h,诱导融合蛋白表达。b.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM, 15℃ 200 r/min振摇过夜,诱导融合蛋白表达。

  (5)(5)取出1 mL培养物,10000 r/min室温离心2 min,弃上清,用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min,离心10 min,弃上清,用 PBS重悬菌体沉淀;重悬液进行超声波破碎后,分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

  (6)进行12% SDS-PAGE检测分析,考马斯亮蓝染色显条带。

3.包涵体蛋白的变性

  (1)将菌体沉淀重悬于20 mL裂解液(20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0),超声破碎(功率400 W,工作4 sec,间歇8 sec,共20 min)。

  (2)将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 r/min离心20 min,收集沉淀。

  (3)使用包涵体洗涤液(20 mM Tris,1 mM EDTA,2 M尿素,1 M NaCl,1% Triton X-100,pH 8.0)洗涤包涵体3次。

  (4)用溶解缓冲液(20 mM Tris,5 mM DTT,0.15M Nacl,8 M尿素,pH 8.0),按一定比例溶解包涵体,4℃放置过夜;室温,10000 r/min离心15 min。搜集上清

  (5)将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ,0.15 M NaCl,pH 8.0缓冲液中,逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌,将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl,pH 8.0溶液中透析过夜。

4.融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

  (1)利用低压层析系统,上清溶液以0.5 mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

  (2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线。

  (3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,8 M尿素,pH 8.0)以1 mL/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线。

  (4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,8 M尿素,pH 8.0)以1 mL/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液。

  (5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,透析至复性缓冲液中过夜,复性结束后,透析至PBS中储存。

  (6)进行12% SDS-PAGE分析。


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