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多肽常见问题探讨

发表时间:2020-12-25 12:39

1.多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的**特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成,基本都是固相合成。其基本过程如下:

    基于Fmoc化学合成,先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点,同其他的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键,不断重复这一过程,即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同,多肽后处理方式不同,纯化方式也有差异。


2.做免疫用的多肽多长为合适?

答:一般约10-15个氨基酸,当然长一些免疫效果好一些,不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上,效果较好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比较差。


3.免疫用多肽的纯度需要很高吗?

答:一般而言,免疫用Peptide70-85%即可。


4.我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗?

答:很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。


5.多肽状态是如何?如何保存储存?


答:我们提供的多肽是粉末状,一般为灰白色,组成不同,多肽粉末的颜色有差异,多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短时间的话是以室温运输。


6.如何溶解多肽?

答:溶解多肽是非常复杂的事情,一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验,在没有确定合适的溶剂前千万不要合部溶解。

下列方法有助于您选择合适的溶剂:

(1)判定多肽的电荷特定,设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)CCOOH-1;碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)NNH2+1,其他氨基酸的电荷为0。计算出将电荷数。

(2)如果净电荷数 >0,多肽为碱性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽还不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(3)如果净电荷数<0,多肽为酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(4)如果净电荷数=0,多肽为中性,一般需要用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。


7.HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?

答:粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如DTTTFA


8.HPLC纯化的多肽有哪些杂质?

答:经过HPLC纯化的多肽,仍会有一些一些杂质存在,其中的杂质主要是短肽和微量TFA


9.多长的多肽为合适?

答:多肽合成需要考虑多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合成粗品的纯度和产率都随着降低,纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的,但是为了多肽的顺利合成,有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基酸,以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短,合成也可能有问题,主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。


10.如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,PheTrp,多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成,都有可能有问题。

(2)一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%,不能连续5个连续aa为疏水性,带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%,在多肽的NC短如果能增加极性氨基酸,也可以改善溶解性。


11.为什么含有Cys,Met,Trp的多肽难合成?

答:含有Cys, Met,Trp的多肽难以合成,同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定,易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。


12.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

答:多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp4个连续Gly.


13.多肽是如何纯化的?

答:多肽纯化一般使用反相柱(C8C18)214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂,pH 2.0 Buffer A为含0.1%TFA in ddH2OBuffer B1%TFA/ACN/ pH 2.0。纯化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解后,然后用Buffer A稀释;对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物,如果多肽不长(15aa以下),一般会有主峰,主峰通常为全长产物;对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需搭配Mass来判定分子量,进而确定哪个峰是所要合成的多肽


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